एटियलॉजिकल निदान वायरल रोगवायरोलॉजिकल, वायरोलॉजिकल, सीरोलॉजिकल और मॉलिक्यूलर जेनेटिक विधियों द्वारा किया जाता है। अंतिम तीन विधियों का उपयोग एक्सप्रेस डायग्नोस्टिक विधियों के रूप में किया जा सकता है।

वायरोलॉजिकल डायग्नोस्टिक विधि।

इस पद्धति का अंतिम लक्ष्य किसी प्रजाति या सीरोलॉजिकल वेरिएंट में वायरस की पहचान करना है।वायरोलॉजिकल विधि में कई चरण शामिल हैं:

1) अनुसंधान के लिए सामग्री का चयन;

2) वायरस युक्त सामग्री का प्रसंस्करण;

3) सामग्री के साथ संवेदनशील जीवित प्रणालियों का संदूषण;

4) जीवित प्रणालियों में वायरस का संकेत;

5) पृथक विषाणुओं का अनुमापन;

6) प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में वायरस की पहचान।

1. शोध के लिए सामग्री का चयन .

यह रोग के प्रारंभिक चरणों में किया जाता है, नियमों के अधीन जो विदेशी माइक्रोफ्लोरा के साथ सामग्री के संदूषण और चिकित्सा कर्मियों के संक्रमण को रोकते हैं। परिवहन के दौरान वायरस की निष्क्रियता को रोकने के लिए, सामग्री को एक वायरल ट्रांसपोर्ट माध्यम (वीटीएस) में रखा जाता है जिसमें संतुलित नमक समाधान, एंटीबायोटिक्स और सीरम एल्ब्यूमिन होता है। सामग्री को ले जाया जाता है विशेष कंटेनरथर्मल इन्सुलेशन और बर्फ युक्त बंद प्लास्टिक बैग के साथ। यदि आवश्यक हो, तो सामग्री को -20˚C पर संग्रहित किया जाता है। अनुसंधान के लिए सामग्री के प्रत्येक नमूने को रोगी के नाम, सामग्री के प्रकार, नमूने की तिथि, विस्तृत नैदानिक ​​निदान और अन्य जानकारी के साथ लेबल और लेबल किया जाना चाहिए।

रोग की प्रकृति के आधार पर, अध्ययन के लिए सामग्री हो सकती है:

1) ग्रसनी के नाक भाग से और ग्रसनी से एक स्वाब;

2) मस्तिष्कमेरु द्रव;

3) मल और मलाशय की सूजन;

6) सीरस गुहाओं से तरल पदार्थ;

7) कंजाक्तिवा से धब्बा;

8) पुटिकाओं की सामग्री;

8) अनुभागीय सामग्री।

ऑरोफरीनक्स से निस्तब्धता प्राप्त करने के लिए 15-20 मिलीलीटर वीटीएस का उपयोग किया जाता है। रोगी 1 मिनट के लिए वीटीएस गले को सावधानी से धोता है और एक बाँझ शीशी में फ्लश एकत्र करता है।

ग्रसनी के पीछे से एक स्मीयर एक बाँझ कपास झाड़ू के साथ लिया जाता है, जीभ की जड़ पर एक स्पैटुला के साथ दबाया जाता है। स्वाब को 2-3 मिलीलीटर वीटीएस में रखा जाता है, धोया जाता है और निचोड़ा जाता है।

मस्तिष्कमेरु द्रव से प्राप्त होता है रीढ़ की हड्डी में छेद. 1-2 मिली मस्तिष्कमेरु द्रवएक बाँझ कंटेनर में रखा और प्रयोगशाला में पहुंचाया।

बाँझ शीशियों में 2-3 दिनों के भीतर मल के नमूने लिए जाते हैं। हांक के घोल का उपयोग करके प्राप्त सामग्री से 10% निलंबन तैयार किया जाता है। निलंबन को 3000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है, सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया जाता है, इसमें एंटीबायोटिक्स जोड़े जाते हैं और एक बाँझ कंटेनर में रखा जाता है।

5-10 मिलीलीटर की मात्रा में वेनिपंक्चर द्वारा प्राप्त रक्त को हेपरिन जोड़कर डिफिब्रिनेट किया जाता है। पूरा रक्त जमता नहीं है और एंटीबायोटिक्स नहीं जोड़े जाते हैं। सीरम प्राप्त करने के लिए, रक्त के नमूनों को 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया जाता है।

सीरस गुहाओं से द्रव 1-2 मिलीलीटर की मात्रा में पंचर द्वारा प्राप्त किया जाता है। तरल का तुरंत उपयोग किया जाता है या जमे हुए रखा जाता है।

कंजंक्टिवा से एक स्मीयर एक बाँझ झाड़ू के साथ लिया जाता है और वीटीएस में रखा जाता है, जिसके बाद सामग्री को सेंट्रीफ्यूज और फ्रीज किया जाता है।

पुटिकाओं की सामग्री को एक पतली सुई के साथ एक सिरिंज से एस्पिरेटेड किया जाता है और वीटीएस में रखा जाता है। सामग्री को कांच की स्लाइडों पर या सीलबंद बाँझ केशिकाओं या ampoules में सूखे स्मीयरों के रूप में प्रयोगशाला में भेजा जाता है।

सड़न रोकनेवाला के नियमों का पालन करते हुए, जितनी जल्दी हो सके अनुभागीय सामग्री ली जाती है। प्रत्येक नमूना एकत्र करने के लिए बाँझ उपकरणों के अलग-अलग सेट का उपयोग किया जाता है। चयनित ऊतकों की मात्रा 1-3 ग्राम है, जिन्हें बाँझ शीशियों में रखा जाता है। सबसे पहले, अतिरिक्त गुहा अंगों के नमूने (मस्तिष्क, लिम्फ नोड्सऔर आदि।)। कपड़े वक्ष गुहाखोलने से पहले ले लो पेट की गुहा. परिणामी ऊतक के नमूनों को एक मोर्टार में बाँझ रेत और बाँझ सोडियम क्लोराइड समाधान के साथ मिलाया जाता है, जिसके बाद सामग्री को सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। सतह पर तैरनेवाला शीशियों में एकत्र किया जाता है, एंटीबायोटिक्स जोड़े जाते हैं। वायरोलॉजिकल अनुसंधान के लिए सामग्री का तुरंत उपयोग किया जाता है या -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।

2. वायरस युक्त सामग्री का प्रसंस्करण।

यह सामग्री को बैक्टीरिया के माइक्रोफ्लोरा से मुक्त करने के लिए किया जाता है। इसके लिए भौतिक और रासायनिक विधियों का उपयोग किया जाता है।

शारीरिक तरीके:

1) विभिन्न जीवाणु फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन;

2) सेंट्रीफ्यूजेशन।

रासायनिक तरीके:

1) वायरस के अलगाव के मामलों में ईथर के साथ सामग्री का उपचार जिसमें सुपरकैप्सिड नहीं होता है;

2) सामग्री में हेप्टेन और फ़्रीऑन का मिश्रण मिलाना;

3) एंटीबायोटिक दवाओं की शुरूआत (पेनिसिलिन - 200-300 यू / एमएल; स्ट्रेप्टोमाइसिन - 200-500 माइक्रोग्राम / एमएल; निस्टैटिन - 100-1000 यू / एमएल)।

3. सामग्री के साथ संवेदनशील जीवित प्रणालियों का संक्रमण।

1) प्रयोगशाला जानवर;

2) चिकन भ्रूण;

3) अंग संस्कृतियों;

4) ऊतक संवर्धन।

प्रयोगशाला जानवर. सफेद चूहे, गिनी पिग, हैम्स्टर, खरगोश आदि का उपयोग किया जाता है। सफेद चूहे बड़ी संख्या में प्रकार के वायरस के प्रति सबसे अधिक संवेदनशील होते हैं। जानवरों के संक्रमण का तरीका वायरस के ऊतकों में ट्रॉपिज्म द्वारा निर्धारित किया जाता है। मस्तिष्क में संक्रमण का उपयोग न्यूरोट्रोपिक वायरस (रेबीज वायरस, पोलियोवायरस, आदि) के अलगाव में किया जाता है। जब रोगजनकों को अलग किया जाता है तो इंट्रानासल संक्रमण किया जाता है श्वासप्रणाली में संक्रमण. व्यापक रूप से इंट्रामस्क्युलर, अंतःशिरा, इंट्रापेरिटोनियल, चमड़े के नीचे और संक्रमण के अन्य तरीकों का उपयोग किया जाता है। बीमार जानवरों को ईथर के साथ euthanized किया जाता है, खोला जाता है और अंगों और ऊतकों से सामग्री ली जाती है।

चिकन भ्रूण. व्यापक रूप से उपलब्ध और उपयोग में आसान। 5 से 14 दिनों की उम्र के चिकन भ्रूण लगाएं। संक्रमण से पहले, चिकन भ्रूण को ओवोस्कोप किया जाता है: उनकी व्यवहार्यता निर्धारित की जाती है, हवा की थैली की सीमा और भ्रूण के स्थान को खोल पर चिह्नित किया जाता है (" काली आँख»भ्रूण)। चिकन भ्रूण के साथ काम एक बाँझ बॉक्स में बाँझ उपकरणों (चिमटी, सीरिंज, कैंची, भाले, आदि) के साथ किया जाता है। काम के एक टुकड़े को पूरा करने के बाद, उपकरणों को 70% एथिल अल्कोहल में डुबोया जाता है और अगले हेरफेर से पहले जला दिया जाता है। संक्रमण से पहले, चिकन भ्रूण के खोल को एक जलती हुई अल्कोहल झाड़ू और आयोडीन के अल्कोहल समाधान से मिटा दिया जाता है। भ्रूण में इंजेक्ट की गई परीक्षण सामग्री की मात्रा 0.1-0.2 मिली है। एक सामग्री से वायरस को अलग करने के लिए कम से कम 4 चूजे के भ्रूण का उपयोग किया जाता है।

वायरोलॉजिकल अनुसंधान के तरीके- वायरस के जीव विज्ञान और उनकी पहचान के अध्ययन के तरीके। वायरोलॉजी में, आणविक जीव विज्ञान के तरीकों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, जिसकी मदद से वायरल कणों की आणविक संरचना को स्थापित करना संभव था, वे कोशिका में कैसे प्रवेश करते हैं और वायरस के प्रजनन की विशेषताएं, वायरल न्यूक्लिक एसिड की प्राथमिक संरचना और प्रोटीन। वायरल न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन अमीनो एसिड के घटक तत्वों के अनुक्रम को निर्धारित करने के तरीके विकसित किए जा रहे हैं। न्यूक्लिक एसिड के कार्यों और प्रोटीन को न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के साथ जोड़ना और इंट्रासेल्युलर प्रक्रियाओं के कारणों को स्थापित करना संभव हो जाता है जो ई-वायरस संक्रमण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।

वायरोलॉजिकल अनुसंधान विधियां भी प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रक्रियाओं (एंटीबॉडी के साथ एंटीजन की बातचीत), वायरस के जैविक गुणों (हेमाग्लगुटिनेट करने की क्षमता, हेमोलिसिस, एंजाइमी गतिविधि), मेजबान सेल के साथ वायरस की बातचीत की विशेषताएं (साइटोपैथिक की प्रकृति) पर आधारित हैं। प्रभाव, इंट्रासेल्युलर समावेशन का गठन, आदि)।

वायरल संक्रमणों के निदान में, वायरस की खेती, अलगाव और पहचान के साथ-साथ वैक्सीन तैयार करने में, ऊतक और कोशिका संवर्धन की विधि का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। प्राथमिक, द्वितीयक, स्थिर सतत और द्विगुणित कोशिका संवर्धन का उपयोग किया जाता है। प्राथमिक संस्कृतियों को प्रोटीयोलाइटिक एंजाइम (ट्रिप्सिन, कोलेजेनेज) के साथ ऊतक को फैलाकर प्राप्त किया जाता है। कोशिकाओं का स्रोत मानव और पशु भ्रूण के ऊतक और अंग (अक्सर गुर्दे) हो सकते हैं। पोषक माध्यम में कोशिकाओं का निलंबन तथाकथित गद्दे, बोतलों या पेट्री डिश में रखा जाता है, जहां, पोत की सतह से जुड़ने के बाद, कोशिकाएं गुणा करना शुरू कर देती हैं। वायरस के संक्रमण के लिए, आमतौर पर एक सेल मोनोलेयर का उपयोग किया जाता है। पोषक तत्व तरल निकाला जाता है, वायरल निलंबन कुछ कमजोर पड़ने में पेश किया जाता है, और कोशिकाओं के संपर्क के बाद, ताजा पोषक माध्यम जोड़ा जाता है, आमतौर पर सीरम के बिना।

अधिकांश प्राथमिक संस्कृतियों की कोशिकाओं को उपसंस्कृत किया जा सकता है और उन्हें द्वितीयक संस्कृतियों के रूप में संदर्भित किया जाता है। कोशिकाओं के आगे बढ़ने के साथ, फ़ाइब्रोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं की आबादी बनती है, जो तेजी से प्रजनन करने में सक्षम होती हैं, जिनमें से अधिकांश गुणसूत्रों के मूल सेट को बनाए रखती हैं। ये तथाकथित द्विगुणित कोशिकाएँ हैं। कोशिकाओं की क्रमिक खेती में, स्थिर निरंतर कोशिका संवर्धन प्राप्त होते हैं। मार्ग के दौरान, गुणसूत्रों के हेटरोप्लोइड सेट के साथ सजातीय कोशिकाओं को तेजी से विभाजित करते हुए दिखाई देते हैं। स्थिर सेल लाइनें मोनोलेयर और सस्पेंशन हो सकती हैं। मोनोलेयर संस्कृतियां कांच की सतह पर एक सतत परत के रूप में विकसित होती हैं, निलंबन संस्कृतियां निलंबन के रूप में बढ़ती हैं विभिन्न जहाजोंमिक्सर का उपयोग करना। 40 विभिन्न जानवरों की प्रजातियों (प्राइमेट्स, पक्षियों, सरीसृप, उभयचर, मछली, कीड़े) और मनुष्यों सहित 400 से अधिक सेल लाइनें हैं।

कृत्रिम पोषक माध्यम में व्यक्तिगत अंगों और ऊतकों (अंग संस्कृतियों) के टुकड़ों की खेती की जा सकती है। इस प्रकार की संस्कृतियां ऊतक संरचना को संरक्षित करती हैं, जो विषाणुओं के अलगाव और पारित होने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जो अविभाजित ऊतक संस्कृतियों (उदाहरण के लिए, कोरोनविर्यूज़) में प्रजनन नहीं करते हैं।

संक्रमित सेल संस्कृतियों में, सेल आकारिकी, साइटोपैथिक क्रिया में परिवर्तन द्वारा वायरस का पता लगाया जा सकता है, जो विशिष्ट हो सकता है, समावेशन की उपस्थिति, सेल में वायरल एंटीजन का निर्धारण करके और संस्कृति तरल पदार्थ में; संवर्धन द्रव में विषाणु संतति के जैविक गुणों का निर्धारण और ऊतक संवर्धन, चूजे के भ्रूण या संवेदनशील पशुओं में विषाणुओं का अनुमापन; फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके आणविक संकरण या साइटोकेमिकल विधि द्वारा न्यूक्लिक एसिड के समूहों द्वारा कोशिकाओं में व्यक्तिगत वायरल न्यूक्लिक एसिड का पता लगाकर।

वायरस का अलगाव एक श्रमसाध्य और लंबी प्रक्रिया है। यह आबादी के बीच प्रसारित होने वाले वायरस के प्रकार या प्रकार को निर्धारित करने के लिए किया जाता है (उदाहरण के लिए, वायरस के सेरोवेरिएंट की पहचान करने के लिए, वायरस का जंगली या टीका तनाव, आदि); ऐसे मामलों में जहां तत्काल महामारी विज्ञान के उपाय करना आवश्यक है; जब नए प्रकार या वायरस के प्रकार प्रकट होते हैं; यदि आवश्यक हो, प्रारंभिक निदान की पुष्टि करें; पर्यावरणीय वस्तुओं में वायरस के संकेत के लिए। वायरस को अलग करते समय, मानव शरीर में उनके बने रहने की संभावना, साथ ही दो या दो से अधिक वायरस के कारण मिश्रित संक्रमण की घटना को ध्यान में रखा जाता है। एक विषाणु से प्राप्त विषाणु की आनुवंशिक रूप से सजातीय जनसंख्या को विषाणु क्लोन कहते हैं, और इसे प्राप्त करने की प्रक्रिया को क्लोनिंग कहते हैं।

वायरस को अलग करने के लिए, अतिसंवेदनशील प्रयोगशाला जानवरों के संक्रमण, चिकन भ्रूण का उपयोग किया जाता है, लेकिन ऊतक संस्कृति का सबसे अधिक उपयोग किया जाता है। वायरस की उपस्थिति आमतौर पर विशिष्ट कोशिका अध: पतन (साइटोपैथिक प्रभाव) द्वारा निर्धारित की जाती है,

कई वायरसों के अलगाव के लिए, उदाहरण के लिए वायरस ए, चिकन भ्रूण का उपयोग कुछ कॉक्ससेकी वायरस और कई अर्बोवायरस - नवजात चूहों के अलगाव के लिए किया जाता है। सीरोलॉजिकल परीक्षणों और अन्य विधियों का उपयोग करके पृथक वायरस की पहचान की जाती है।

वायरस के साथ काम करते समय, उनका अनुमापांक निर्धारित किया जाता है। वायरस का अनुमापन आमतौर पर टिशू कल्चर में किया जाता है, जो वायरस युक्त तरल पदार्थ के उच्चतम कमजोर पड़ने का निर्धारण करता है, जिस पर ऊतक अध: पतन होता है, समावेशन और वायरस-विशिष्ट एंटीजन बनते हैं। प्लाक विधि का उपयोग कई विषाणुओं को अनुमापन करने के लिए किया जा सकता है। सजीले टुकड़े, या वायरस की नकारात्मक कॉलोनियां, अगर कोटिंग के तहत सिंगल-लेयर टिशू कल्चर के वायरस-नष्ट कोशिकाओं के फॉसी हैं। कॉलोनी काउंटिंग इस आधार पर वायरस की संक्रामक गतिविधि के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है कि एक संक्रामक वायरस कण एक पट्टिका बनाता है। सजीले टुकड़े की पहचान महत्वपूर्ण रंगों के साथ संस्कृति को धुंधला करके की जाती है, आमतौर पर तटस्थ लाल; सजीले टुकड़े डाई का सोखना नहीं करते हैं और इसलिए सना हुआ जीवित कोशिकाओं की पृष्ठभूमि के खिलाफ हल्के धब्बे के रूप में दिखाई देते हैं। वायरस का अनुमापांक 1 में पट्टिका बनाने वाली इकाइयों की संख्या के रूप में व्यक्त किया जाता है एमएल.

विषाणुओं का शुद्धिकरण और सांद्रण आमतौर पर विभेदक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा किया जाता है, इसके बाद सांद्रता या घनत्व ग्रेडिएंट्स में सेंट्रीफ्यूजेशन किया जाता है। विषाणुओं को शुद्ध करने के लिए प्रतिरक्षी विधियों, आयन-विनिमय क्रोमैटोग्राफी, इम्यूनोसॉर्बेंट्स आदि का उपयोग किया जाता है।

वायरल संक्रमण के प्रयोगशाला निदान में नैदानिक ​​सामग्री में रोगज़नक़ या उसके घटकों का पता लगाना शामिल है; इस सामग्री से वायरस अलगाव; सेरोडायग्नोसिस प्रत्येक व्यक्तिगत मामले में प्रयोगशाला निदान पद्धति का चुनाव रोग की प्रकृति, रोग की अवधि और प्रयोगशाला की क्षमताओं पर निर्भर करता है। आधुनिक निदानवायरल संक्रमण एक्सप्रेस विधियों पर आधारित है जो आपको रोग के बाद प्रारंभिक अवस्था में नैदानिक ​​सामग्री लेने के कुछ घंटों बाद प्रतिक्रिया प्राप्त करने की अनुमति देता है। इनमें इलेक्ट्रॉन और प्रतिरक्षा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी शामिल हैं,

नकारात्मक दाग वाले वायरस की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी वायरस के भेदभाव और उनकी एकाग्रता के निर्धारण की अनुमति देती है। वायरल संक्रमण के निदान में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग उन मामलों तक सीमित है जहां नैदानिक ​​सामग्री में वायरल कणों की एकाग्रता पर्याप्त रूप से अधिक है (1 में 5 5) एमएलऔर उच्चा)। विधि का नुकसान एक ही टैक्सोनोमिक समूह से संबंधित वायरस के बीच अंतर करने में असमर्थता है। प्रतिरक्षा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इस नुकसान को समाप्त कर दिया गया है। विधि प्रतिरक्षा परिसरों के गठन पर आधारित है जब वायरल कणों में विशिष्ट सीरम जोड़ा जाता है, जबकि वायरल कणों की एक साथ एकाग्रता होती है, जिससे उन्हें पहचानना संभव हो जाता है। एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए भी विधि का उपयोग किया जाता है। एक्सप्रेस डायग्नोस्टिक्स के उद्देश्य से, ऊतक के अर्क, मल, पुटिकाओं से तरल पदार्थ और नासॉफिरिन्क्स से रहस्यों की एक इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म जांच की जाती है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का व्यापक रूप से वायरस के आकारिकी का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है; लेबल वाली एंटीबॉडी के उपयोग के साथ इसकी क्षमताओं का विस्तार किया जाता है।

वायरस-विशिष्ट न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के आधार पर आणविक संकरण की विधि, जीन की एकल प्रतियों का पता लगाना संभव बनाती है और संवेदनशीलता के मामले में इसके बराबर नहीं है। प्रतिक्रिया डीएनए या आरएनए (जांच) के पूरक किस्में के संकरण और डबल-फंसे संरचनाओं के निर्माण पर आधारित है। सबसे सस्ता जांच क्लोन पुनः संयोजक डीएनए है। जांच को रेडियोधर्मी अग्रदूतों (आमतौर पर रेडियोधर्मी फास्फोरस) के साथ लेबल किया जाता है। वर्णमिति प्रतिक्रियाओं का उपयोग आशाजनक है। आणविक संकरण के कई प्रकार हैं: बिंदु संकरण, धब्बा संकरण, सैंडविच संकरण, स्वस्थानी संकरण, आदि।

एलजीएम वर्ग के एंटीबॉडी कक्षा जी एंटीबॉडी (बीमारी के 3-5 वें दिन) से पहले दिखाई देते हैं और कुछ हफ्तों के बाद गायब हो जाते हैं, इसलिए उनका पता लगाना हाल के संक्रमण का संकेत देता है। आईजीएम वर्ग के एंटीबॉडी का पता एंटी-एम एंटीसेरा (एंटी-आईजीएम हेवी चेन सेरा) का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस या एंजाइम इम्यूनोसे द्वारा लगाया जाता है।

वायरोलॉजी में सीरोलॉजिकल तरीके शास्त्रीय प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रतिक्रियाओं पर आधारित हैं (देखें। प्रतिरक्षाविज्ञानी अनुसंधान के तरीके ): पूरक निर्धारण प्रतिक्रियाएं

पूर्व प्रोटीन शुद्धिकरण के बिना जटिल मिश्रण में वायरस और एंटीबॉडी के अलग-अलग एंटीजन की पहचान करने के लिए, इम्युनोब्लॉटिंग का उपयोग किया जाता है। विधि एंजाइम इम्यूनोएसे द्वारा प्रोटीन के बाद के इम्युनोसे के साथ पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके प्रोटीन विभाजन को जोड़ती है। प्रोटीन का पृथक्करण एंटीजन की रासायनिक शुद्धता की आवश्यकताओं को कम करता है और व्यक्तिगत एंटीजन-एंटीबॉडी जोड़े की पहचान करना संभव बनाता है। यह कार्य प्रासंगिक है, उदाहरण के लिए, एचआईवी संक्रमण के सेरोडायग्नोसिस में, जहां झूठी सकारात्मक एंजाइम इम्यूनोएसे प्रतिक्रियाएं कोशिका प्रतिजनों के प्रति एंटीबॉडी की उपस्थिति के कारण होती हैं, जो वायरल प्रोटीन की अपर्याप्त शुद्धि के परिणामस्वरूप मौजूद होती हैं। आंतरिक और बाहरी वायरल एंटीजन के लिए रोगियों के सीरा में एंटीबॉडी की पहचान रोग के चरण को निर्धारित करना संभव बनाती है, और आबादी के विश्लेषण में - वायरल प्रोटीन की परिवर्तनशीलता। एचआईवी संक्रमण में इम्युनोब्लॉटिंग का उपयोग व्यक्तिगत वायरल एंटीजन और उनके प्रति एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एक पुष्टिकरण परीक्षण के रूप में किया जाता है। आबादी का विश्लेषण करते समय, वायरल प्रोटीन की परिवर्तनशीलता को निर्धारित करने के लिए विधि का उपयोग किया जाता है। विधि का महान मूल्य पुनः संयोजक डीएनए प्रौद्योगिकी का उपयोग करके संश्लेषित एंटीजन का विश्लेषण करने, उनके आकार को स्थापित करने और एंटीजेनिक निर्धारकों की उपस्थिति की संभावना में निहित है।

ग्रंथ सूची:बुकरिन्स्काया ए.जी. वायरोलॉजी, एम।, 1986; वायरोलॉजी, मेथड्स, एड. बी मेखी, ट्रांस। अंग्रेजी से, एम।, 1988; हैंडबुक ऑफ माइक्रोबायोलॉजिकल एंड वायरोलॉजिकल रिसर्च मेथड्स, एड। एमओ बिगर, एम।, 1982।

बैक्टीरिया के विपरीत, वायरस केवल जीवित कोशिकाओं में ही प्रजनन करते हैं। इस संबंध में, प्रायोगिक पशु (चिकन भ्रूण के रूप में) के जीव के स्तर पर वायरस की खेती की जा सकती है विकासशील जीवप्रायोगिक जानवरों के रूप में संदर्भित) या शरीर के बाहर विकसित एक जीवित कोशिका, अर्थात। सेल संस्कृति स्तर पर।

प्रयोगशाला पशुओं का उपयोग। वायरस को अलग करने और विकसित करने के तरीकों में से एक प्रयोगशाला जानवरों को संक्रमित करना है। उनका उपयोग वायरस को अलग करने के लिए किया जाता है जो सेल संस्कृतियों में साइटोपैथिक परिवर्तनों के विकास का कारण नहीं बनते हैं और चिकन भ्रूण में गुणा नहीं करते हैं। प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग से नैदानिक ​​लक्षण परिसर द्वारा वायरल संक्रमण की प्रकृति की पहचान करना भी संभव हो जाता है। सफेद चूहे, हम्सटर, गिनी सूअर, खरगोश। बड़े जानवरों में से, विभिन्न प्रजातियों के बंदरों और कुछ अन्य जानवरों का उपयोग किया जाता है। पक्षियों से मुर्गियों, गीज़, बत्तखों का उपयोग किया जाता है। हाल के वर्षों में, नवजात जानवरों (वायरस के प्रति अधिक संवेदनशील), "बाँझ जानवर" (गर्भाशय से निकाले गए और बाँझ हवा और निष्फल भोजन का उपयोग करके बाँझ परिस्थितियों में रखे जाते हैं) और ज्ञात आनुवंशिकता वाले शुद्ध वंश के जानवर (अंतर्निहित या रैखिक जानवर) हैं। अधिक बार उपयोग किया जाता है।

केवल स्वस्थ जानवरों को ही प्रयोग में लिया जाता है, अधिमानतः एक नर्सरी और एक बैच से। शरीर के तापमान को उसी समय मापा जाता है, क्योंकि इसमें दैनिक उतार-चढ़ाव होता है। परीक्षण सामग्री को कुछ ऊतकों में वायरस के ट्रॉपिज्म को ध्यान में रखते हुए प्रशासित किया जाता है। तो, न्यूट्रोट्रोपिक वायरस के अलगाव के लिए, सामग्री को मस्तिष्क में इंजेक्ट किया जाता है, न्यूमोट्रोपिक वायरस के अलगाव के लिए - नाक के माध्यम से (प्रकाश ईथर एनेस्थेसिया के तहत)।

प्रयोगशाला जानवरों में, वायरस युक्त सामग्री के संक्रमण के बाद, आगे के शोध के लिए सामग्री को समय पर और सही तरीके से और असंगत रूप से लेना महत्वपूर्ण है। यदि उचित ऊष्मायन अवधि के बाद जानवर में संक्रमण के लक्षण विकसित होते हैं तो वायरस अलगाव के परिणाम सकारात्मक माने जाते हैं।

चूजे के भ्रूण का उपयोग। भ्रूण के ऊतकों में, इसकी झिल्ली, जर्दी थैली, कई रोगजनक मानव और पशु वायरस गुणा करने में सक्षम होते हैं। इस मामले में, एक विशेष ऊतक के लिए वायरस की चयनात्मकता महत्वपूर्ण है: चेचक के वायरस अच्छी तरह से प्रजनन करते हैं और कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली की कोशिकाओं में जमा होते हैं, एमनियन में कण्ठमाला वायरस, एमनियन और एलांटोइस में इन्फ्लूएंजा वायरस और रेबीज वायरस जर्दी थैली में।

विकासशील भ्रूणों में वायरस की खेती के अन्य तरीकों की तुलना में कई फायदे हैं: एक घना खोल काफी मज़बूती से रोगाणुओं से आंतरिक सामग्री की रक्षा करता है; मुर्गी के भ्रूण को संक्रमित करते समय, खेती के अन्य तरीकों की तुलना में वायरस युक्त सामग्री की अधिक उपज प्राप्त होती है; चिकन भ्रूण के संक्रमण की विधि सरल और किसी भी वायरोलॉजिकल प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ है; भ्रूण में बाहरी कारकों के रोगजनकों के लिए पर्याप्त व्यवहार्यता और प्रतिरोध होता है। हालांकि, चिकन भ्रूण हमेशा गुप्त वायरल से मुक्त नहीं होते हैं और जीवाण्विक संक्रमण. गतिकी का पालन करना मुश्किल रोग संबंधी परिवर्तनभ्रूण में वायरस के संक्रमण के बाद होता है। संक्रमित भ्रूण के ऑटोप्सी में अक्सर दिखाई देने वाले परिवर्तन नहीं दिखते हैं और एक रक्तगुल्म परीक्षण और अन्य तरीकों का उपयोग करके वायरस का पता लगाता है। संक्रमित भ्रूण में, एंटीबॉडी टिटर में वृद्धि का पालन करना असंभव है। विधि सभी वायरस के लिए उपयुक्त नहीं है।

वायरोलॉजिकल अध्ययन के लिए 7-12 दिन की उम्र के भ्रूणों का उपयोग किया जाता है, जो पोल्ट्री फार्म से प्राप्त किए जाते हैं। आप एक पारंपरिक थर्मोस्टेट में भ्रूण विकसित कर सकते हैं, जिसके नीचे हवा को नम करने के लिए पानी के साथ ट्रे रखी जाती हैं। थर्मोस्टेट में तापमान 37 डिग्री सेल्सियस और आर्द्रता 60-65% होनी चाहिए। सफेद मुर्गियों से बड़े, साफ (लेकिन बिना धुले), निषेचित अंडे का चयन करें, 5-10 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर 10 दिनों से अधिक समय तक संग्रहीत नहीं किया जाता है। निषेचित अंडे को एक जर्मिनल डिस्क की उपस्थिति से पहचाना जाता है, जो एक ओवोस्कोप के साथ पारभासी होने पर एक काले धब्बे की तरह दिखता है।

वायरस के साथ काम करते समय इस्तेमाल किया जा सकता है विभिन्न तरीकेभ्रूण का संक्रमण, लेकिन कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली के लिए वायरस का अनुप्रयोग, एलांटोइक, एमनियोटिक गुहा और जर्दी थैली में परिचय को सबसे बड़ा व्यावहारिक अनुप्रयोग प्राप्त हुआ

(चित्र 10.5)। विधि का चुनाव अध्ययन के तहत वायरस के जैविक गुणों पर निर्भर करता है।

चावल। 10.5.

संक्रमण से पहले, भ्रूण की व्यवहार्यता एक ओवोस्कोप पर निर्धारित की जाती है। जीवित भ्रूण मोबाइल होते हैं, झिल्लियों के जहाजों का स्पंदन स्पष्ट रूप से दिखाई देता है। मोमबत्ती जलाते समय, खोल पर एक साधारण पेंसिल से हवा की थैली की सीमाओं या भ्रूण के स्थान को चिह्नित करें, जो कि खोल पर इसकी छाया से निर्धारित होता है।

चिकन भ्रूणों को एक बॉक्स में सख्त सड़न रोकनेवाला परिस्थितियों में उबालने वाले उपकरणों का उपयोग करके संक्रमित किया जाता है।

कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली पर संक्रमित होने पर, 12-दिन के भ्रूण सबसे उपयुक्त होते हैं। एलैंटोइक कैविटी में संक्रमण के लिए, 10-11 दिनों के भ्रूण का उपयोग किया जाता है, एमनियोटिक गुहा में - 7-11 दिन की उम्र के भ्रूण, जर्दी थैली में - 7 दिन की उम्र के भ्रूण।

संक्रमित भ्रूण वाले अंडों को स्टैंड पर ब्लंट एंड अप के साथ रखा जाता है। तापमान शासन और ऊष्मायन अवधि टीका वायरस के जैविक गुणों पर निर्भर करती है। ओवोस्कोप के तहत प्रतिदिन भ्रूण की व्यवहार्यता की निगरानी की जाती है। चोट के कारण संक्रमण के बाद पहले दिन मरने वाले भ्रूण की जांच नहीं की जाती है।

सामग्री एकत्र करने से पहले, भ्रूण को जहाजों को संकुचित करने और शव परीक्षा में रक्तस्राव को रोकने के लिए 18-20 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा किया जाता है। सड़न रोकनेवाला के नियमों के अनुपालन में बॉक्स में भ्रूण खोले जाते हैं।

Allantoic द्रव को एक पिपेट के साथ चूसा जाता है, बाँझपन को चीनी या मांस-पेप्टोन शोरबा में टीका द्वारा नियंत्रित किया जाता है, रक्तगुल्म प्रतिक्रिया में एक वायरस की उपस्थिति के लिए जाँच की जाती है और एक जमे हुए अवस्था में 4 ° C पर संग्रहीत किया जाता है।

एमनियोटिक द्रव प्राप्त करने के लिए, ऐलांटोइक द्रव को पहले एस्पिरेटेड किया जाता है, फिर एमनियोटिक झिल्ली को चिमटी से पकड़ लिया जाता है, थोड़ा ऊपर उठा लिया जाता है, और एमनियोटिक द्रव को पाश्चर पिपेट से चूसा जाता है।

कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली में परिवर्तन का अध्ययन करते समय, इसे कैंची से काटा जाता है और सभी सामग्री को छेद के माध्यम से पेट्री डिश में डाला जाता है। कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली खोल के अंदर रहती है और चिमटी के साथ खारा के साथ पेट्री डिश में हटा दी जाती है। यहां इसे धोया जाता है, सीधा किया जाता है और एक गहरे रंग की पृष्ठभूमि के खिलाफ फोकल घावों की प्रकृति का अध्ययन किया जाता है।

एम्नियोटिक झिल्ली प्राप्त करने के लिए, एम्नियोटिक थैली जिसमें भ्रूण संलग्न होता है उसे काटकर भ्रूण से मुक्त किया जाता है, जिसे घावों के लिए देखा जाता है।

जर्दी झिल्ली प्राप्त करने के लिए, कोरियोन-एलांटोइस को काट दिया जाता है, एलांटोइक और एमनियोटिक तरल पदार्थ चूस जाते हैं, भ्रूण को चिमटी से हटा दिया जाता है, गर्भनाल द्वारा अलग किया जाता है, जर्दी थैली को पकड़ लिया जाता है और पेट्री डिश में रखा जाता है। बाँझपन के लिए नियंत्रण, घावों की उपस्थिति के लिए देखें। जर्दी, यदि आवश्यक हो, जर्दी थैली को हटाए बिना एक सिरिंज के साथ हटाया जा सकता है।

संक्रमित भ्रूण के ऐलांटोइक और एमनियोटिक द्रवों में वायरस की उपस्थिति रक्तगुल्म परीक्षण में निर्धारित की जाती है। भ्रूण से तरल पदार्थ एक सकारात्मक परिणामबाँझपन के लिए परीक्षण के बाद रक्तगुल्म को एक विस्तारित रक्तगुल्म प्रतिक्रिया में संयोजित और अनुमापन किया जाता है।

थोड़ी मात्रा में वायरस की उपस्थिति या परीक्षण सामग्री में इसका पता लगाने की असंभवता में, चिकन भ्रूण पर क्रमिक मार्ग किए जाते हैं। यदि, भ्रूण पर तीन बाद के मार्ग के बाद, परीक्षण सामग्री में वायरस का पता नहीं चलता है, तो परिणाम नकारात्मक माना जाता है।

सेल संस्कृतियों का उपयोग। शरीर के बाहर कोशिकाओं की खेती के लिए कई शर्तों की पूर्ति की आवश्यकता होती है। उनमें से एक काम के दौरान बाँझपन का सख्त पालन है, क्योंकि उपयोग किए जाने वाले पोषक तत्व बैक्टीरिया और कवक के लिए भी एक उत्कृष्ट पोषक तत्व हैं। ऊतक कोशिकाएं लवण के प्रति बहुत संवेदनशील होती हैं। भारी धातुओं. इसलिए, बनाने वाले विभिन्न अवयवों की गुणवत्ता को असाधारण महत्व देना आवश्यक है खारा समाधानऔर पोषक माध्यम, साथ ही सेल संस्कृति में उपयोग किए जाने वाले व्यंजन और रबर स्टॉपर्स को संसाधित करने के तरीके।

में से एक अनिवार्य शर्तेंकोशिकाओं के साथ सफल कार्य आसुत जल की उच्च गुणवत्ता है (सप्ताह में दो बार जाँच की जाती है)। कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए, बिडिस्टिल या विआयनीकृत पानी का उपयोग किया जाता है। सबसे अच्छा डिस्टिलर कांच या मिश्र धातु इस्पात से बने उपकरण होते हैं: भारी धातु आयन, जो कोशिकाओं के लिए जहरीले होते हैं, ऐसे उपकरणों से नहीं धोए जाते हैं। विआयनीकृत पानी विशेष प्रतिष्ठानों पर प्राप्त किया जाता है, जहां आयनों एक्सचेंजर और कटियन एक्सचेंजर के साथ स्तंभों के माध्यम से इसके क्रमिक मार्ग के दौरान लवण से पानी को शुद्ध किया जाता है।

कोशिकाओं की खेती करते समय, व्यंजन और स्टॉपर्स की तैयारी और नसबंदी पर विशेष रूप से उच्च आवश्यकताओं को रखा जाता है। कई मामलों में, यह उनकी अनुचित धुलाई और नसबंदी है जो कोशिकाओं को कांच से नहीं जोड़ने या सेल मोनोलेयर के तेजी से अध: पतन का कारण बनता है।

शरीर के बाहर कोशिकाओं के विकास और प्रजनन के लिए, भौतिक-रासायनिक कारकों के एक जटिल सेट की आवश्यकता होती है: एक निश्चित तापमान, हाइड्रोजन आयनों, अकार्बनिक यौगिकों, कार्बोहाइड्रेट, अमीनो एसिड, प्रोटीन, विटामिन, ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड की एकाग्रता, इसलिए कोशिका संवर्धन में विषाणुओं की खेती के लिए जटिल पोषक माध्यमों का उपयोग किया जाता है। उनकी रचना करने वाले घटकों की प्रकृति के अनुसार, इन मीडिया को दो समूहों में विभाजित किया गया है।

• 1. मीडिया, जो खारा समाधान (हैंक्स, अर्ल, आदि) और प्राकृतिक घटकों (पशु और मानव रक्त सीरम, एल्ब्यूमिन हाइड्रोलाइज़ेट) के मिश्रण हैं। मीडिया के विभिन्न फॉर्मूलेशन में इन घटकों में से प्रत्येक की मात्रा अलग-अलग होती है।
• 2. सिंथेटिक और अर्ध-सिंथेटिक मीडिया जिसमें अमीनो एसिड, विटामिन, कोएंजाइम और न्यूक्लियोटाइड (ईगल मीडिया, 199 आदि) के साथ खारा समाधान (अर्ल, हैंक्स, आदि) शामिल हैं। सिंथेटिक मीडिया में, कोशिकाएं व्यवहार्य अवस्था में थोड़े समय (7 दिनों तक) के लिए मौजूद रह सकती हैं। उन्हें लंबे समय तक व्यवहार्य स्थिति में बनाए रखने के लिए, साथ ही कोशिकाओं के विकास और प्रजनन के लिए बेहतर स्थिति बनाने के लिए, पशु रक्त सीरम (गायों, बछड़ों, आदि) को सिंथेटिक मीडिया में जोड़ा जाता है।

वायरस को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विभिन्न तरीकेशरीर के बाहर संवर्धन कोशिकाएं। हालांकि, वर्तमान में, प्राथमिक ट्रिप्सिनाइज्ड और प्रतिरोपित सेल लाइनों की एकल-परत संस्कृतियों को सबसे बड़ा व्यावहारिक अनुप्रयोग प्राप्त हुआ है। सिंगल-लेयर सेल संस्कृतियों को 1 लीटर, 250 और 100 मिलीलीटर की क्षमता वाले कांच के फ्लैट-दीवार वाले जहाजों-गद्दों में या उचित तरीके से इलाज किए गए पारंपरिक बैक्टीरियोलॉजिकल टेस्ट ट्यूबों में उगाया जाता है।

प्राथमिक ट्रिप्सिनाइज्ड सेल संस्कृतियों का उपयोग करते समय, विधि का सार प्रोटीयोलाइटिक एंजाइमों द्वारा ऊतकों में अंतरकोशिकीय बंधनों के विनाश और कांच की सतह पर एक मोनोलेयर विकसित करने के लिए कोशिकाओं के पृथक्करण में निहित है। मानव और पशु भ्रूण, वध किए गए जानवरों और पक्षियों के ऊतक और अंग, साथ ही शल्य चिकित्सा के दौरान मनुष्यों से निकाले गए, कोशिकाओं को प्राप्त करने के स्रोत के रूप में काम कर सकते हैं। सामान्य और घातक अपक्षयी ऊतकों, उपकला, फाइब्रोब्लास्टिक प्रकार और मिश्रित का प्रयोग करें। शरीर से निकाली गई कोशिकाओं को पुन: उत्पन्न करने की क्षमता ऊतक भेदभाव की डिग्री से निकटता से संबंधित है। ऊतक जितना कम विभेदित होता है, उसकी कोशिकाओं की इन विट्रो में प्रसार करने की क्षमता उतनी ही अधिक तीव्र होती है। इसलिए, वयस्क जानवरों की सामान्य कोशिकाओं की तुलना में भ्रूण और ट्यूमर के ऊतकों की कोशिकाएं शरीर के बाहर संस्कृति के लिए बहुत आसान होती हैं।

उनकी वृद्धि की प्रकृति को निर्धारित करने के लिए दैनिक संस्कृतियों को कम आवर्धन माइक्रोस्कोप के तहत देखा जाता है। यदि कोशिकाओं का प्रसार नहीं होता है, तो कांच से गोल, दानेदार, गहरा और परतदार दिखता है, कांच के बने पदार्थ खराब तरीके से संसाधित होते हैं या संस्कृति माध्यम में सामग्री विषाक्त होती है।

प्राथमिक ट्रिप्सिनाइज्ड ऊतकों के साथ, प्रतिरोपित कोशिका संवर्धन व्यापक रूप से वायरस की खेती के लिए उपयोग किया जाता है; कोशिका संवर्धन शरीर के बाहर अनिश्चित काल तक प्रजनन करने में सक्षम है। सामान्य और कैंसरग्रस्त मानव ऊतकों से प्राप्त सेल संस्कृतियों का सबसे अधिक उपयोग किया जाता है। सर्वाइकल ट्यूमर से प्राप्त हेला सेल लाइन, स्वरयंत्र कार्सिनोमा से हेप-2, ओरल कैविटी कैंसर टिश्यू से केवी व्यापक रूप से ज्ञात हो गया है। इस तरह के सेल कल्चर को सामान्य जानवरों के ऊतकों से भी तैयार किया जाता है - एक बंदर के गुर्दे, एक खरगोश और एक सुअर के भ्रूण (तालिका 10.1)।

प्रतिरोपित कोशिकाओं को फिर से बोने के लिए पोषक माध्यम को पिपेट से चूसा जाता है और बाहर निकाल दिया जाता है। कोशिकाओं की बनी पतली परत को ट्रिप्सिन के घोल से नष्ट कर दिया जाता है और इस तरह से निकलने वाली कोशिकाओं को स्थानांतरित कर दिया जाता है नया पोतताजा पोषक घोल के साथ, जहां कोशिकाओं का एक मोनोलेयर फिर से बनता है।

संक्रमित सेल संस्कृतियों में वायरस की उपस्थिति का एक संकेतक हो सकता है:

• क) विशिष्ट कोशिका अध: पतन का विकास;
• बी) इंट्रासेल्युलर समावेशन का पता लगाना;
• सी) इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा एक विशिष्ट एंटीजन का पता लगाना;
• डी) सकारात्मक रक्तशोधन प्रतिक्रिया;
• ई) सकारात्मक रक्तगुल्म प्रतिक्रिया;
• ई) सजीले टुकड़े का गठन।

तालिका 10.1

सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली सेल संस्कृतियों की सूची

संक्रमित संस्कृतियों में विशिष्ट अध: पतन का पता लगाने के लिए, कम आवर्धन माइक्रोस्कोप के तहत प्रतिदिन कोशिकाओं की जांच की जाती है। कई वायरस, कोशिकाओं में गुणा करते समय, उनके अध: पतन का कारण बनते हैं, अर्थात। एक साइटोपैथोजेनिक प्रभाव (सीपीए) (चित्र। 10.6) है।

चावल। 10.6.

संक्रमित सेल संस्कृतियों में विकास का समय और साइटोपैथिक परिवर्तनों की प्रकृति इनोक्यूलेटेड वायरस के गुणों और खुराक के साथ-साथ सेल की खेती के गुणों और स्थितियों से निर्धारित होती है। कुछ वायरस संक्रमण के बाद पहले सप्ताह के भीतर सीपीपी का कारण बनते हैं (पॉक्स, पोलियो, कॉक्ससेकी बी, आदि), अन्य - 1-2 सप्ताह के बाद। संक्रमण के बाद (एडेनोवायरस, पैरेन्फ्लुएंजा वायरस, ईसीएचओ, आदि)।

वायरस तीन मुख्य प्रकार के साइटोपैथिक परिवर्तन का कारण बनते हैं: बहुकेंद्रीय विशाल कोशिकाओं और सिम्प्लास्ट का निर्माण, जो कई कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य के संलयन का परिणाम हैं; इंटरसेलुलर कनेक्शन के नुकसान और कोशिकाओं के गोल होने के परिणामस्वरूप गोल कोशिका अध: पतन; कोशिकाओं की कई परतों से मिलकर कोशिका प्रसार के foci का विकास।

कोशिका संवर्धन में कुछ विषाणुओं के प्रजनन के दौरान, प्रभावित कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य या केंद्रक में अंतःकोशिकीय समावेशन बनते हैं। समावेशन का पता लगाने के लिए सेल संस्कृतियों को वायरस से संक्रमित टेस्ट ट्यूब में कांच की प्लेटों पर उगाया जाता है, और कुछ ऊष्मायन अवधि के बाद, पारंपरिक रंगों के साथ धुंधला करके तैयारी तैयार की जाती है।

संक्रमित सेल संस्कृतियों में एक विशिष्ट एंटीजन का पता लगाने के लिए, तैयारी उसी तरह तैयार की जाती है जैसे एमएफए का उपयोग करके समावेशन का पता लगाने के लिए।

पट्टिका विधि विकृत (मृत) कोशिकाओं से युक्त फीके पड़े क्षेत्रों के एक अग्र कोटिंग के तहत वायरस से संक्रमित कोशिकाओं के एक मोनोलेयर में गठन पर आधारित है। ये क्षेत्र, जिन्हें प्लाक कहा जाता है, वायरस कॉलोनियां हैं, जो आमतौर पर एक ही वायरल कण से बनती हैं।

साइटोपैथिक परिवर्तनों की अनुपस्थिति में, इंट्रासेल्युलर समावेशन, पट्टिका गठन, नकारात्मक प्रतिक्रियापरीक्षण सामग्री से संक्रमित सेल संस्कृतियों में रक्तशोधन और रक्तगुल्म, बाद के दो मार्ग किए जाते हैं। अंतिम मार्ग में इन परिवर्तनों की अनुपस्थिति में, वायरस अलगाव का परिणाम नकारात्मक माना जाता है।

संक्रामक सामग्री में वायरस का पता लगाने के लिए निम्नलिखित विधियों का उपयोग किया जा सकता है।

सूक्ष्म:

• ए) वायरोस्कोपी;
• बी) इंट्रासेल्युलर समावेशन का पता लगाना।

प्रतिरक्षाविज्ञानी:

• ए) प्रतिरक्षा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी;
• बी) इम्यूनोफ्लोरेसेंस;
• ग) रक्तगुल्म;
• घ) रक्तशोषण।

निम्नलिखित प्रतिक्रियाओं सहित, प्रतिरक्षाविज्ञानी विधियों का उपयोग करके वायरस की पहचान की जाती है:

• ए) रक्तगुल्म का निषेध;
• बी) hemadsorption देरी;
• ग) पूरक बंधन;
• डी) तटस्थता;
• ई) अगर जेल में वर्षा।

सूक्ष्म तरीके। प्रकाश सूक्ष्मदर्शी से केवल 150 एनएम से बड़े बड़े विषाणुओं का ही पता लगाया जा सकता है। छोटे विषाणुओं की पहचान केवल इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी से ही संभव है। बड़े वायरस का पता लगाने के लिए प्रकाश, चरण विपरीत और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है।

वायरल संक्रमण के दौरान, संक्रमित कोशिकाओं में अजीबोगरीब समावेशन विकसित होते हैं। कुछ संक्रमण प्रभावित कोशिकाओं (रेबीज, चेचक के टीके) के साइटोप्लाज्म में समावेशन के साथ होते हैं, अन्य - साइटोप्लाज्म और न्यूक्लियस (खसरा, प्राकृतिक और छोटी माता, एडेनोवायरस रोग)। समावेशन की प्रकृति, संरचना, आकार और आकार 0.25 से 25 माइक्रोन तक भिन्न होता है। आधुनिक आंकड़ों के अनुसार, कुछ संक्रमणों में, समावेशन वायरस के प्रजनन का स्थल होता है और कोशिका पदार्थों से घिरे इसके संचय का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि अन्य में, वे कोशिका अध: पतन का एक उत्पाद हैं।

अंगों और ऊतकों के दाग वाले प्रिंट, सेल स्क्रैपिंग, प्रभावित ऊतक से ऊतकीय वर्गों और वायरस से संक्रमित सेल संस्कृति की तैयारी में समावेशन का पता लगाया जा सकता है। रंग अक्सर रोमानोव्स्की-गिमेसा पद्धति के अनुसार किया जाता है। इस विधि द्वारा धुंधला करने के लिए, पिक्रिक एसिड, फॉर्मेलिन, अल्कोहल, डबॉस्क-ब्राजील-बौइन के मिश्रण में तैयारी तय की जाती है। सिरका अम्ल. अधिकांश वायरल संक्रमणों में इंट्रासेल्युलर समावेशन रोमानोव्स्की-गिमेसा विधि के अनुसार ऑक्सीफिलिक और दाग गुलाबी या बकाइन होते हैं।

वायरल संक्रमण के निदान के लिए इम्यूनोलॉजिकल तरीके। हाल के वर्षों में, ये तरीके वायरल संक्रमण के प्रयोगशाला निदान में अग्रणी बन गए हैं। यह काफी हद तक आर्थिक कारणों से है, क्योंकि वायरोलॉजिकल विश्लेषण के शास्त्रीय तरीके काफी महंगे हैं। इसके अलावा, वायरोलॉजिकल विधियों (सप्ताह) का उपयोग करते हुए अध्ययन की अवधि, भले ही वे काफी प्रभावी हों, उन्हें पूर्वव्यापी बनाते हैं।

विभिन्न बायोसबस्ट्रेट्स और पर्यावरणीय वस्तुओं में वायरल एंटीजन का पता लगाने के लिए और सेरोडायग्नोसिस के लिए इम्यूनोलॉजिकल तरीकों का उपयोग किया जाता है - बीमार लोगों और प्रयोगशाला जानवरों के रक्त सीरा में वायरल एंटीजन के एंटीबॉडी का पता लगाना। इसके अलावा, विषाणुओं की पहचान के लिए प्रतिरक्षाविज्ञानी अनुसंधान विधियां अपरिहार्य हैं।

शरीर के साथ बातचीत करते हुए, वायरस एंटीबॉडी के गठन का कारण बनते हैं, जो कि विषाणुओं पर अधिशोषित होते हैं, कोशिकाओं में विषाणुओं के प्रवेश को रोकते हैं और साइटोपैथिक क्रिया (सीपीई) के विकास को रोकते हैं; चिकन भ्रूण और जानवरों में प्रजनन के दौरान वायरस के घातक प्रभाव को बेअसर करना; हेमाग्लगुटिनिन और न्यूरामिनिडेस को निष्क्रिय करें, वायरस से प्रभावित कोशिकाओं पर रक्तगुल्म प्रतिक्रिया (आरजीए) और हेमडॉरशन प्रतिक्रिया (आरजीएडी) को रोकें। ये वायरस-बेअसर करने वाले एंटीबॉडी भी वायरल कणों के एकत्रीकरण और वर्षा का कारण बनते हैं, और परिणामी प्रतिरक्षा परिसरों को पूरक बनाते हैं। इसलिए, विषाणुओं की पहचान के लिए, सेल संस्कृतियों, चिकन भ्रूण और जानवरों और इसके संशोधनों पर शास्त्रीय तटस्थता प्रतिक्रिया (पीएच) का उपयोग किया जाता है: हेमाग्लगुटिनेशन अवरोध प्रतिक्रिया (एचआईटीए); रक्त सोखना निषेध प्रतिक्रिया (RTGads)। एक ज्ञात वायरल एंटीजन (डायग्नोस्टिकम) के अनुसार रोगियों के सीरम में वायरस-बेअसर करने वाले एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए वायरल संक्रमण के सीरोडायग्नोसिस में समान प्रतिक्रियाओं का उपयोग किया जाता है।

इम्यूनोइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (आईईएम) की विधि। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी वर्तमान में वायरस के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का डेटा है जो वायरस के आधुनिक वर्गीकरण के आधार के रूप में कार्य करता है।

वायरस के इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म अध्ययन के विकास में एक नया चरण इम्यूनोइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग है। इस पद्धति का उपयोग करके, न केवल वायरस का प्रत्यक्ष पता लगाया जा सकता है, बल्कि उनकी पहचान भी की जा सकती है, साथ ही वायरल उपभेदों का तेजी से सीरोटाइपिंग और उनके लिए एंटीबॉडी का अनुमापन संभव हो गया है। एक मैक्रोऑर्गेनिज्म की कोशिकाओं के अंदर वायरल एंटीजन के स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए आईईएम ने बहुत महत्व प्राप्त किया।

आईईएम का निस्संदेह लाभ पारंपरिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विधियों की तुलना में इसकी उच्च संवेदनशीलता है।

जब कोई विषाणु प्रतिजन या विषाणु घटक समजात प्रतिसेरम के संपर्क में आता है, तो एक प्रतिरक्षी-प्रतिजन संकुल का निर्माण होता है। यह घटना वायरल एंटीजन या एंटीबॉडी का पता लगाने और उनकी पहचान करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक का आधार है। यह नकारात्मक धुंधलापन के बाद एंटीबॉडी वाले एंटीजन के कॉम्प्लेक्स हैं जिन्हें इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में देखा जा सकता है। नैदानिक ​​​​निदान में, एंटीजेनिक सामग्री को पूरी तरह से शुद्धिकरण की आवश्यकता नहीं होती है। इसलिए, यदि एक इन्फ्लूएंजा वायरस का पता चला है, तो अशुद्ध एलैंटोइक तरल पदार्थ की जांच की जा सकती है। वर्तमान में, यह माना जाता है कि लगभग किसी भी प्रकार की नैदानिक ​​सामग्री आईईएम के लिए उपयुक्त है। नैदानिक ​​​​उद्देश्यों के लिए, साधारण अव्यवस्थित सीरा, साथ ही साथ दीक्षांत समारोह के सीरा का उपयोग किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अंतिम परिणाम बड़ा प्रभावएंटीजन और एंटीबॉडी की मात्रा का अनुपात प्रदान करता है। प्रतिजन की अधिकता के साथ, कणों की एक बहुतायत देखी जाती है; इस मामले में agglomerates कुछ ही होंगे। एंटीबॉडी की अधिकता के साथ, वायरल कण अपनी मोटी परत से घिरे होते हैं, विषाणु के छोटे संरचनात्मक विवरणों को प्रकट करना लगभग असंभव है; समुच्चय भी कम हैं। प्रतिजन और एंटीबॉडी के इष्टतम अनुपात के साथ, समुच्चय विषाणुओं के विवरण की एक अच्छी छवि के साथ बढ़े हुए हैं। उपरोक्त विचारों से, कई कमजोर पड़ने पर प्रतिरक्षा सीरम का उपयोग करना वांछनीय है।

पैलेडियम से बनी एक सपोर्ट फिल्म को सपोर्ट ग्रिड पर लगाया जाता है। पैलेडियम की कम सांद्रता का उपयोग करते समय और सब्सट्रेट के सोखना गुणों में सुधार करने के लिए, इसे कार्बन के साथ प्रबलित किया जाता है। ऐसा करने के लिए, वैक्यूम में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक ग्रिड पर तैयार सूखी फिल्म-सब्सट्रेट पर कोयले का छिड़काव किया जाता है। फिल्म-सब्सट्रेट की मोटाई और मजबूत कार्बन परत का वस्तु के बारीक विवरण के विपरीत और छवि पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। प्रत्येक शोधकर्ता सब्सट्रेट फिल्मों की विशिष्ट मोटाई और कार्बन परत को अलग-अलग निर्धारित करता है, इस तथ्य के आधार पर कि कार्बन पैलेडियम की तुलना में अधिक इलेक्ट्रॉनिक रूप से पारदर्शी है।

उनके लिए वायरस और एंटीबॉडी में कम इलेक्ट्रॉन घनत्व होता है। इसलिए, पूर्व-उपचार के बिना इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जैविक वस्तुओं का पता नहीं लगाया जा सकता है। एक नकारात्मक कंट्रास्ट (या नकारात्मक दाग) तकनीक का उपयोग करके वायरस की कल्पना की जाती है। भारी धातुओं के विभिन्न लवणों का उपयोग वायरस और वायरस-एंटीबॉडी परिसरों के नकारात्मक धुंधलापन के लिए किया जाता है। कंट्रास्टिंग एजेंट (भारी धातु परमाणु) वस्तुओं के हाइड्रोफिलिक क्षेत्रों में प्रवेश करते हैं और उनमें पानी की जगह लेते हैं। नतीजतन, वस्तु का इलेक्ट्रॉन घनत्व बढ़ जाता है, और इसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में देखना संभव हो जाता है।

प्रत्यक्ष IEM पद्धति ने व्यवहार में सबसे बड़ा अनुप्रयोग पाया है। वाइरस सस्पेंशन को undiluted एंटीसेरम के साथ मिलाया जाता है। जोरदार सरगर्मी के बाद, मिश्रण 1 घंटे के लिए ऊष्मायन किया जाता है

37 डिग्री सेल्सियस, फिर रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर। अगले दिन, प्रतिरक्षा परिसरों को उपजी करने के लिए मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। अवक्षेप को आसुत जल की एक बूंद में पुन: निलंबित कर दिया जाता है और नकारात्मक विपरीतता के अधीन किया जाता है।

IEM के परिणामों का मूल्यांकन करते समय, एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में एक एंटीजन और एक एंटीबॉडी के बीच बातचीत के उत्पादों का एक अलग रूप हो सकता है (एक व्यक्तिगत वायरल कण पूरे या आंशिक रूप से एंटीबॉडी के साथ कवर किया जाता है; वायरल कणों के समूह)। एग्लोमेरेट्स एक अलग क्षेत्र पर कब्जा कर सकते हैं, अलग हैं दिखावट, कणों की एक अलग संख्या होते हैं। इसलिए, प्रयोगात्मक लोगों के साथ, नियंत्रण तैयारी (एक बफर समाधान या विषम एंटीसेरम के साथ) का अध्ययन करना आवश्यक है।

आईईएम का उपयोग करके प्राप्त परिणामों के मूल्यांकन के लिए मानदंड तैयारियों में प्रतिरक्षा सीरम द्वारा एकत्रित वायरल कणों के समूहों की उपस्थिति या अनुपस्थिति है। एंटीजन एग्लोमेरेट्स और विशिष्ट एंटीसेरम एंटीबॉडी की उपस्थिति एक सकारात्मक प्रतिक्रिया का संकेत है। फिर भी, हाई-स्पीड सेंट्रीफ्यूजेशन के प्रभाव में एंटीजन कणों के गैर-विशिष्ट एकत्रीकरण की संभावना को ध्यान में रखा जाना चाहिए। इस कारण से, कई लेखक 0 से 4+ के सशर्त पैमाने पर परिणामों पर विचार करने की सलाह देते हैं। यह सीरम एंटीबॉडी के साथ एकत्रित कणों के कवरेज की डिग्री के आकलन पर आधारित है।

रक्तगुल्म और रक्तशोषण के तरीके। कई वायरस में स्तनधारियों और पक्षियों की कड़ाई से परिभाषित प्रजातियों के एरिथ्रोसाइट्स को एकत्रित करने की क्षमता होती है। उदाहरण के लिए, इन्फ्लूएंजा वायरस कण्ठमाला का रोगमुर्गियों, गिनी सूअरों, मनुष्यों के एग्लूटीनेट एरिथ्रोसाइट्स; टिक-जनित एन्सेफलाइटिस वायरस - भेड़ एरिथ्रोसाइट्स; जापानी एन्सेफलाइटिस वायरस - एक दिवसीय मुर्गियों और गीज़ के एरिथ्रोसाइट्स; एडेनोवायरस - चूहों, चूहों, बंदरों के एरिथ्रोसाइट्स। एलांटोइक और एमनियोटिक तरल पदार्थ, चिकन भ्रूण के कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली का निलंबन, वायरस से संक्रमित जानवरों की कोशिकाओं या अंगों की संस्कृतियों से निलंबन और अर्क का उपयोग रक्तगुल्म प्रतिक्रिया (एचए) में परीक्षण सामग्री के रूप में किया जाता है। हीमाग्लगुटिनेशन प्रतिक्रिया कांच पर ड्रिप विधि द्वारा और टेस्ट ट्यूब या पॉलीस्टाइन प्लेट्स के कुओं में एक विस्तारित पंक्ति में सेट की जा सकती है। पहली विधि सांकेतिक है।

समूह-विशिष्ट होने के कारण, RGA वायरस की प्रजातियों को निर्धारित करना संभव नहीं बनाता है। हेमग्लूटीनेशन इनहिबिटेशन टेस्ट (HITA) का उपयोग करके उनकी पहचान की जाती है। इसके निर्माण के लिए ज्ञात प्रतिरक्षा एंटीवायरल सेरा का उपयोग किया जाता है। प्रत्येक कमजोर पड़ने पर समान मात्रा में वायरस युक्त तरल मिलाया जाता है। नियंत्रण वायरस का निलंबन है।

मिश्रण को थर्मोस्टेट में रखा जाता है, फिर एरिथ्रोसाइट्स का निलंबन जोड़ा जाता है। कुछ मिनट बाद, न्यूट्रलाइजिंग सीरम का टिटर निर्धारित किया जाता है, अर्थात। इसका अधिकतम कमजोर पड़ना, जिसके कारण एरिथ्रोसाइट एग्लूटिनेशन में देरी हुई।

वायरल रोगों के सीरोलॉजिकल निदान में, आरटीजीए को युग्मित सीरा के साथ करने की सिफारिश की जाती है, जिनमें से एक रोग की शुरुआत में प्राप्त होता है, और दूसरा 1-2 सप्ताह या उससे अधिक के बाद। दूसरे सीरम में एंटीबॉडी टिटर में चार गुना वृद्धि प्रस्तावित निदान की पुष्टि करती है।

हेमाडसॉर्प्शन रिएक्शन (आरजीएडी) का उपयोग संक्रमित सेल संस्कृतियों में हेमाग्लगुटिनेटिंग गतिविधि वाले वायरस को इंगित करने के लिए किया जाता है। प्रतिक्रिया का सार इस तथ्य में निहित है कि वायरस से संक्रमित कोशिकाओं की सतह पर वायरस के हेमाग्लगुटिनेटिंग क्रिया के प्रति संवेदनशील एरिथ्रोसाइट्स को सोख लिया जाता है। उदाहरण के लिए, चिकन एरिथ्रोसाइट्स वेरियोला वायरस से संक्रमित कोशिकाओं पर अधिशोषित होते हैं; खसरा वायरस - बंदरों के एरिथ्रोसाइट्स; एडेनोवायरस - बंदर और चूहे, आदि।

न्यूट्रलाइजेशन रिएक्शन (PH)। कोशिका संवर्धन में पुनरुत्पादन, वायरस विभिन्न प्रकार के सीपीडी का कारण बनते हैं, जो गोलाई, झुर्रीदार, कमी या, इसके विपरीत, कोशिका के आकार में वृद्धि, उनके संलयन और सिम्प्लास्ट के गठन, साइटोप्लाज्म और नाभिक के विनाश में व्यक्त होते हैं। अंत में, वायरस से संक्रमित कोशिकाओं के एक मोनोलेयर में, कोशिका परत के कुछ वर्गों के विनाश के परिणामस्वरूप, "बाँझ धब्बे" या सजीले टुकड़े दिखाई दे सकते हैं, जो वायरल कण का एक क्लोन हैं, जो न केवल संभव बनाता है वायरस को अलग करें, लेकिन इसके टिटर को भी निर्धारित करें।

प्लेक की प्रकृति से वायरस की पहचान करना बहुत मुश्किल है, और इसलिए वे अलग-अलग वायरस के पीएच को ज्ञात वायरस-बेअसर करने वाले सेरा के साथ सेट करने का सहारा लेते हैं। इस प्रयोजन के लिए, रोगी से प्राप्त वायरस सेल कल्चर में जमा हो जाता है और इसके विभिन्न तनुकरणों को बिना पतला एंटीवायरल सीरम के साथ मिलाया जाता है।

वायरस और सीरा का मिश्रण चूजों के भ्रूण या संवेदनशील जानवरों को संक्रमित कर सकता है। ऐसे मामलों में, एंटीबॉडी की बेअसर करने वाली गतिविधि अक्सर भ्रूण के तरल पदार्थ में वायरल हेमाग्लगुटिनिन के बेअसर होने और भ्रूण और जानवरों पर वायरस के घातक प्रभाव को समाप्त करने से निर्धारित होती है। उसी समय, न्यूट्रलाइज़ेशन इंडेक्स की गणना की जाती है, जो इस सीरम द्वारा निष्प्रभावी होने वाले वायरस की घातक खुराक की अधिकतम संख्या को एक के रूप में लिए गए नियंत्रण प्रयोग के परिणामों की तुलना में व्यक्त करता है।

इसी तरह, पीएच का उपयोग करके, रोगियों की सामग्री से पृथक वायरस की पहचान की जाती है जब वे चिकन भ्रूण और जानवरों को संक्रमित करते हैं। ऐसा करने के लिए, भ्रूण के वायरस युक्त तरल पदार्थ और जानवरों के प्रभावित अंगों के निलंबन को वायरस-बेअसर करने वाले सीरा में जोड़ा जाता है। एक निश्चित ऊष्मायन समय के बाद, कोशिका संवर्धन, चूजे के भ्रूण और जानवर मिश्रण से संक्रमित हो जाते हैं।

वायरल संक्रमणों के सेरोडायग्नोसिस में, एक ज्ञात वायरस के लिए वायरस-बेअसर करने वाले एंटीबॉडी के अनुमापांक में वृद्धि की गतिशीलता निर्धारित की जाती है। साथ ही, रोग की शुरुआत और अंत में रोगियों से लिए गए युग्मित सीरा के साथ PH सेट किया जाता है। निदान उनमें से दूसरे में इम्युनोग्लोबुलिन के अनुमापांक में 4 गुना वृद्धि होगी।

PH क्षमता पर आधारित होता है विशिष्ट एंटीबॉडीवायरल कण के लिए पर्याप्त रूप से बांधें। वायरस और एंटीबॉडी के बीच बातचीत के परिणामस्वरूप, संवेदनशील कोशिकाओं के साथ वायरल कण के कनेक्शन के लिए जिम्मेदार एंटीजेनिक निर्धारकों की नाकाबंदी के कारण वायरस की संक्रामक गतिविधि बेअसर हो जाती है। नतीजतन, वायरस इन विट्रो या विवो में एक संवेदनशील जैविक प्रणाली में गुणा करने की क्षमता खो देता है।

PH के परिणाम वायरस और उसके समजात एंटीबॉडी के मिश्रण के बाद स्पष्ट हो जाते हैं, एक समयबद्ध एक्सपोजर के बाद, एक संवेदनशील जैविक प्रणाली (टिशू सेल कल्चर, चिक भ्रूण, अतिसंवेदनशील पशु शरीर) में पेश किया जाता है, जहां वायरस गुणा कर सकता है और औसत दर्जे का कारण बन सकता है। ऐसे परिवर्तन जो एंटीबॉडी की उपस्थिति में आंशिक रूप से या पूरी तरह से दब जाएंगे।

PH में तीन घटक शामिल होते हैं:

• 1) वायरस;
• 2) एंटीबॉडी युक्त सीरम;
• 3) एक जैविक वस्तु (प्रयोगशाला जानवर, चिकन भ्रूण विकसित करना, ऊतक संस्कृतियों), जिसकी पसंद वायरस के प्रकार पर निर्भर करती है जिसके साथ इसे अनुसंधान करना है।

PH का उपयोग या तो एक पृथक रोगज़नक़ की पहचान करने के लिए या सीरा में एंटीबॉडी का पता लगाने और अनुमापन करने के लिए किया जाता है। पहले मामले में, विशेष रूप से प्रतिरक्षित प्रयोगशाला जानवरों या बरामद लोगों के सीरा का उपयोग किया जाता है। दूसरे मामले में, रोग के प्रारंभिक चरण में और आरोग्य अवधि के दौरान लिए गए सीरा का उपयोग किया जाता है।

एंटीहेमग्लगुटिनिन या पूरक-फिक्सिंग एंटीबॉडी के विपरीत, बरामद लोगों के सीरा में वायरस-बेअसर करने वाले एंटीबॉडी कई वर्षों तक बने रहते हैं, और कुछ वायरल संक्रमणों (उदाहरण के लिए, खसरा) में भी जीवन के लिए बने रहते हैं। यह कुछ मामलों में एक संदर्भ दवा के रूप में कई दीक्षांत समारोहों के सीरा के पूल का उपयोग करना संभव बनाता है, जो कि ampoules और lyophilization में भरने के बाद, लंबे समय तक नैदानिक ​​​​कार्य के लिए उपयुक्त है।

पृथक रोगजनकों की पहचान करते समय, विभिन्न जानवरों के पूर्व-तैयार हाइपरिम्यून सीरा का उपयोग किया जाता है: खरगोश, सफेद चूहे और चूहे, गिनी सूअर, बंदर, भेड़, घोड़े, आदि। PH के लिए हाइपरइम्यून सीरा की गतिविधि जानवरों के प्रतिरक्षण की विधि पर निर्भर करती है।

प्रत्येक न्यूट्रलाइजेशन प्रयोग को स्थापित करने से पहले, वायरस का पूर्व-अनुमापन किया जाता है, अंतिम कमजोर पड़ने का निर्धारण करता है जो ऊतक संस्कृति को नुकसान पहुंचाता है या प्रयोगशाला जानवरों (या चिकन भ्रूण) के संक्रमण का कारण बनता है। वायरस टिटर को 50% खुराक (TCID50 - टिशू कल्चर के लिए 50% संक्रामक खुराक) के रूप में व्यक्त किया जाता है।

वायरोलॉजिकल प्रैक्टिस में आणविक आनुवंशिक निदान के तरीके। आणविक जीव विज्ञान के तरीके 50 के दशक में विकसित किए गए थे। XX सदी। वे इस तथ्य के कारण संभव हो गए कि प्रत्येक वायरस के जीनोम में अद्वितीय प्रजाति-विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम होते हैं, जिनका पता लगाकर किसी भी संक्रामक एजेंट की पहचान की जा सकती है। ये विधियां उन सूक्ष्मजीवों की पहचान करने में सबसे महत्वपूर्ण हैं जो पारंपरिक तरीकों से लंबे समय तक या मुश्किल से खेती करते हैं। 1970 के दशक में, डीएनए जांच का पता लगाने के लिए एक संक्रामक एजेंट या उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था, जो एक पृथक डीएनए नमूने के साथ रेडियोधर्मी आइसोटोप (या फ्लोरोक्रोम) के साथ लेबल किए गए विशिष्ट ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच के संकरण पर आधारित था। संकरण विश्लेषण न्यूक्लिक एसिड की क्षमता का शोषण करता है कुछ शर्तेंन्यूक्लिक एसिड के साथ विशिष्ट परिसरों का निर्माण करते हैं जिनके अनुक्रम उनके पूरक होते हैं। डीएनए संकरण द्वारा संक्रामक रोगजनकों का पता लगाने की विधि अत्यंत श्रमसाध्य, समय लेने वाली और महंगी निकली। इसके अलावा, नैदानिक ​​सामग्री जैसे मल और मूत्र में सूक्ष्मजीवों की पहचान के लिए इसकी संवेदनशीलता अपर्याप्त है।

डीएनए संकरण को एक ऐसे तरीके से बदल दिया गया है जो डीएनए की प्राकृतिक प्रतिकृति की नकल करता है और आपको थर्मोफिलिक डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके एक निश्चित डीएनए टुकड़े का पता लगाने और बार-बार कॉपी करने की अनुमति देता है। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) एक सुंदर तकनीक है जो प्राकृतिक डीएनए प्रतिकृति की नकल करती है और थर्मोफिलिक डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके डीएनए के एक विशिष्ट टुकड़े का पता लगाने और बार-बार कॉपी करने की अनुमति देती है।

अपने उच्च नैदानिक ​​गुणों के कारण, पीसीआर एक मान्यता प्राप्त पूरक है पारंपरिक तरीकेवायरोलॉजी में उपयोग किया जाता है: सेल कल्चर में वायरस का प्रसार, वायरल एंटीजन का इम्यूनोलॉजिकल डिटेक्शन, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी। इस पद्धति का एक महत्वपूर्ण लाभ अव्यक्त संक्रमणों (साइटोमेगालोवायरस, हर्पीज वायरस) में वायरस का पता लगाने की क्षमता है और ऐसे वायरस जो अभी तक विकसित करना मुश्किल या असंभव है (मानव इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस, एपस्टीन-बार वायरस, मानव पेपिलोमावायरस, विदर हेपेटाइटिस वायरस)। Creutzfeldt-Jakob रोग, अल्जाइमर रोग और मल्टीपल स्केलेरोसिस जैसी बीमारियों के अध्ययन की संभावनाएं पीसीआर पद्धति से जुड़ी हैं।

पाठ संख्या 2 7

विषय: संवेदनशील कोशिकाओं के साथ वायरस की बातचीत। खेती करना। संकेत तरीकेऔर पहचान।एंटीवायरल प्रतिरक्षा।

जांच सूची

1. वायरस, प्रकृति और उत्पत्ति। डिस्कवरी इतिहास। वायरोलॉजी के विकास के चरण। विषाणु की अवधारणा, इसकी संरचना। वायरस की रासायनिक संरचना और गुण।

2. विषाणुओं के वर्गीकरण के सिद्धांत - मानदंड। आरएनए और डीएनए युक्त वायरस (नियंत्रण) के परिवार।

3. विषाणुओं का उष्ण कटिबंध। संवेदनशील कोशिकाओं के साथ वायरस की बातचीत - चरण।

4. विषाणुओं की खेती। कोशिका संवर्धन और चूजे के भ्रूणों पर उनकी खेती के दौरान विषाणुओं का संकेत और पहचान। सेल संस्कृतियों, सेल लाइनों, उत्पादन, खेती की स्थिति।

5. वायरल संक्रमणों का वर्गीकरण: क) कोशिका स्तर पर; बी) जीव के स्तर पर।

6. तरीके प्रयोगशाला निदानविषाणु संक्रमण। नैदानिक ​​सामग्री के अध्ययन के लिए प्रत्यक्ष तरीके (वायरस, वायरल एंटीजन या वायरल एनके का पता लगाना)। वायरोलॉजिकल डायग्नोस्टिक विधि। वायरल संक्रमण का सेरोडायग्नोसिस।

7. एंटीवायरल प्रतिरक्षा - कारक। प्रजाति प्रतिरोध। गैर-विशिष्ट एंटीवायरल सुरक्षा कारक (अवरोधक, इंटरफेरॉन, पूरक, फागोसाइटोसिस)। एक्वायर्ड इम्युनिटी (हास्य और सेलुलर तंत्र)।

8. वायरल संक्रमण की विशिष्ट रोकथाम और चिकित्सा के सिद्धांत: टीके, प्रतिरक्षा सीरा (इम्युनोग्लोबुलिन), इंटरफेरॉन, एटियोट्रोपिक कीमोथेरेपी।

प्रयोगशाला कार्य

वायरल संक्रमण का प्रयोगशाला निदान

1. एक्सप्रेस डायग्नोस्टिक्स के लिए उपयोग करें:

ए) वायरल प्रतिजन निर्धारणप्रतिक्रियाओं में नैदानिक ​​​​एंटीवायरल सेरा का उपयोग करके परीक्षण सामग्री में: आरआईएफ, एलिसा, आरआईए, काउंटर इम्यूनोइलेक्ट्रोफोरेसिस (वीईईएफ), निष्क्रिय हेमग्लूटीनेशन रिएक्शन (आरपीएचए), हेमाग्लगुटिनेशन इनहिबिटेशन रिएक्शन (आरटीजीए), आदि;

वी) विषाणु का पता लगानाइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या आईईएम का उपयोग करके रोग संबंधी सामग्री में।

डी) वायरस जीनोम का पता लगानाआणविक आनुवंशिक तरीके: पीसीआर; लेबल की गई जांच का उपयोग करके न्यूक्लिक एसिड का आणविक संकरण।

2. वायरोलॉजिकल विधि

मुख्य चरण:

1. परीक्षण सामग्री का नमूना।

2. साइटोट्रोपिज्म के सिद्धांत के अनुसार चयन और एक संवेदनशील परीक्षण प्रणाली प्राप्त करना, इसकी व्यवहार्यता का निर्धारण करना।

3. चयनित प्रणाली का संक्रमण।

4. इसके न्यूक्लिक एसिड, एंटीजन, हेमाग्लगुटिनिन, सीपीई, समावेशन का पता लगाने के आधार पर वायरस का संकेत।

5. वायरस की पहचान और अनुमापन किसके आधार पर किया जाता है:

ए) प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रतिक्रियाओं (आरआईएफ, एलिसा, आरपीएचए, आरएसके, आरएन, वीआईईएफ, आदि) का उपयोग करके वायरस एंटीजन का निर्धारण; बी) अंगों और ऊतकों की पैथोहिस्टोलॉजिकल परीक्षा; ग) सीपीडी; जी) नैदानिक ​​लक्षण, जैविक नमूने (केराटोकोनजंक्टिवल, आदि)।

वायरोलॉजिकल विधि (योजना)

जांच की गई सामग्री (मल, नासॉफिरिन्जियल स्वैब, अनुभागीय सामग्री, आदि)

जीवाणु और कवक को दबाने के लिए एंटीबायोटिक उपचार

माइक्रोफ्लोरा, सेंट्रीफ्यूजेशन, निस्पंदन

श्रृंखला संक्रमण

चिकन भ्रूण